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[文獻(xiàn)精讀] 如何鑒定游離DNA的身份

2017-08-24 00:00來源:原版作者:Jerry Li


 血液中的游離DNAcfDNA)是液體活檢的首要關(guān)注點。 為了精準(zhǔn)檢測這些游離的DNA片段, 我們就需要關(guān)注游離DNA的基本特征,比如濃度、片段大小、序列、穩(wěn)定性等【1-4】。 但是更重要的問題,是怎樣鑒定這些游離DNA的身份。 身份指導(dǎo)行為。 比如說我們有了新同事或是新鄰居,好奇的我們首先想要知道新人的身份,從哪里來,以前做過什么,這樣基本可以預(yù)測這人的行為。根據(jù)同樣的思路,我們關(guān)注游離DNA的身份,即它們從哪里來,到哪里去, 哪些是靶向DNA, 哪些是干擾DNA, 哪些DNA在哪些生理環(huán)境下有哪些生物學(xué)行為。這些知識無疑會幫助我們設(shè)計更新更好的,來穩(wěn)定、保護(hù)和檢測游離DNA

在液態(tài)活檢的科研領(lǐng)域,我們可以借助目前已經(jīng)建立了的模型,來總結(jié)游離DNA的行為特征,從而鑒定其身份。在這里我們重點討論血液凝集系統(tǒng)和創(chuàng)傷系統(tǒng), 這兩個系統(tǒng)的特點是它們都有非常訊速變化的血液環(huán)境。 這樣的環(huán)境里, 游離DNA的水平處于顯著的動態(tài)變化中,這就為我們提供了非常獨特和寶貴的視角,為我們闡釋了游離DNA身份提供了依據(jù)。

1.從血液凝集看游離DNA動態(tài)變化

血漿和血清作為最常見的血液樣品,分別是采血系統(tǒng)的抗凝和促凝的產(chǎn)物,它們內(nèi)含的游離DNA的水平有很大差異【5-12】。 在配對對比試驗中,科研人員對同一患者的血樣在其他條件都對等的條件下, 對比分析了血漿樣品和血清樣品,發(fā)現(xiàn)血清里的游離DNA的水平是血漿的14倍【5】到20倍【6】。 這里指的是新鮮血清和血漿的比對,如果觀察貯存的樣品,人們發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)的游離DNA水平在穩(wěn)步上升, 在4°C的環(huán)境里保存5天的血清樣本,游離DNA的水平可以在本底基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高100倍,而同等條件下的血漿里游離DNA的水平基本不變【6】。

由于血清是血液凝集后的產(chǎn)物,一系列的級聯(lián)凝集反應(yīng)導(dǎo)致血小板富集,化學(xué)介質(zhì)釋放,核酸以及核酸酶釋放,這些都是導(dǎo)致血清中DNA水平的變化的可能原因。 我們已經(jīng)知道的是,血清中升高的DNA有相當(dāng)部分是來自白細(xì)胞中釋放的基因組DNA。 這些DNA不僅量很高,水平和化學(xué)性質(zhì)也很不穩(wěn)定【13-15】。 更重要的是,對于液體活檢項目中我們關(guān)注的靶分子,比如無創(chuàng)產(chǎn)檢中的胎兒DNA,  血清中的量反而比血漿中更少【16】。 這很可能來自于白細(xì)胞釋放的DNA酶對于游離DNA的降解作用。

2.血清不適合做液體活檢的樣品

液體活檢樣品的大忌就是(1)相關(guān)DNA的量小,(2)無關(guān)DNA的量大。 這兩點在血清中都體現(xiàn)出來了。 那么血清是否是不適合做液體活檢的樣品? 我們來看看腫瘤監(jiān)測的情況,因為腫瘤監(jiān)測相對于產(chǎn)檢、創(chuàng)傷監(jiān)測這些常規(guī)檢查,腫瘤監(jiān)測的難度更大,是液體活檢的終極挑戰(zhàn)。在【17】肺癌患者的血漿對血清的配對對比實驗中,血漿檢測可以看出患者的游離DNA的量顯著地高于健康人(24.5ng/mL vs 5.1ng/mL, 而血清檢測的結(jié)果顯示肺癌患者和健康人的游離DNA水平是一樣的。 也就是說,在液態(tài)活檢的高難度項目中,使用血漿是比血清能更有效地檢出腫瘤的存在。  液體活檢的樣品準(zhǔn)備對結(jié)果有直接影響,血清樣品因為其高水平的基因組DNA以及核酸酶,給液體活檢的靶分子檢測提高了難度,因而不適合做液體活檢。

我們同時應(yīng)該看到,血液樣品中的游離DNA是處于動態(tài)變化的, 即便是血漿樣品,它內(nèi)部的游離DNA水平也在穩(wěn)步提高。 同樣是血漿樣品,在常規(guī)采血管(比如EDTA管)中的游離DNA可能比特殊采血管(比如BCT)中高上百倍【18】。 所以對于液體活檢的樣品處理,使用細(xì)胞穩(wěn)定劑來穩(wěn)定血液細(xì)胞,是保護(hù)cfDNA是根本的解決辦法【19-23】。關(guān)于血細(xì)胞的穩(wěn)定和血液樣品貯存運輸,可以參照我們的《液體活檢通訊-2017.6: 樣本處理對cfDNA和液體活檢的影響 》。  

3. 從創(chuàng)傷看游離DNA的消長

如果說血清樣品中游離DNA變化是局部的、人為促成的,那么創(chuàng)傷(trauma)過程中游離DNA變化則反映了整體的、有機的變化,所以能更加有信服力第說明游離DNA的動態(tài)和來源。 根據(jù)對創(chuàng)傷患者的檢測,患者血液中游離DNA的水平是無一例外是升高的【24-35】。 經(jīng)典的研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷發(fā)生的20分鐘內(nèi),血液中游離DNA的水平就能夠被檢出有顯著升高【24】。如果患者的創(chuàng)傷情況在幾小時內(nèi)穩(wěn)定下來,游離DNA的水平就會穩(wěn)定并開始下降, 反之如果患者情況惡化并最終導(dǎo)致器官衰竭, 游離DNA的水平會持續(xù)保存在高點上,最長的可以達(dá)到28天。根據(jù)創(chuàng)傷的種類和嚴(yán)重程度, 游離DNA的水平也不同,所以游離DNA的水平是創(chuàng)傷預(yù)后的一個重要指標(biāo)。這些觀察涵蓋了多種創(chuàng)傷,包括外科手術(shù)、開放性傷口、灼傷、化學(xué)燒傷等,這些創(chuàng)傷都看到了游離DNA水平的迅速升高。在2017年的一份綜述文章里, 人們列舉了14個針對創(chuàng)傷ICU的臨床研究,共計904名患者, 結(jié)論是在創(chuàng)傷病例中,高水平的游離DNA和高死亡率是顯著相關(guān)的【35】。

更多的研究發(fā)現(xiàn),對于創(chuàng)傷導(dǎo)致的肺損傷、呼吸壓力癥的患者,相對于最終沒有引發(fā)這些并發(fā)癥的患者,他們的游離DNA的水平要高12倍【25】。刺穿創(chuàng)傷的患者的游離DNA水平高于鈍擊創(chuàng)傷的患者,并發(fā)感染的患者的游離DNA水平高于比沒有感染的患者【26】。在創(chuàng)傷患者的系統(tǒng)里,不僅核源的游離DNA水平升高,線粒體DNA的水平也升高【28】。這些結(jié)果也進(jìn)一步說明,游離DNA和機體應(yīng)急狀態(tài)密切相關(guān),和凝血過程密切相關(guān)。

4. 游離DNA參與機體防御和凝血

細(xì)胞的死亡,無論是正常細(xì)胞的凋亡,還是癌細(xì)胞的死亡,都會造成游離DNA的量增【35-40】。 加上人們對血液凝集過程以及創(chuàng)傷的觀察,很自然地推論出游離DNA的來源是細(xì)胞死亡造成的。 進(jìn)一步的推論很可能就是,游離DNA只是死亡細(xì)胞的釋放產(chǎn)物,雖然它有重要的示蹤作用,可以幫助鑒別癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞,但游離DNA是被動的、沒有功能的細(xì)胞廢物, 在血樣中逐漸減少并消失呢, 實際情況是否是這樣呢?  實際情況總是復(fù)雜得多。

根據(jù)對血液白細(xì)胞和凝血的細(xì)致研究,人們發(fā)現(xiàn)游離DNA是中性粒胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, 簡稱NET)的重要組成部分【41-51】 。 中性粒胞外陷阱是近年來新發(fā)現(xiàn)的免疫防御系統(tǒng),在外來病原體(比如細(xì)菌)或是免疫信號的刺激下,中性粒細(xì)胞會釋放出特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來纏在病原體,防止其擴(kuò)散和增生。 這個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就是中性粒胞外陷阱, 是由游離DNA、組蛋白和抗微生物蛋白組成的【41】。 沒有游離DNA就不會形成中性粒胞外陷阱, 如果用DNA酶來降解DNA會導(dǎo)致 中性粒胞外陷阱的失活。 這在客觀上解釋了為什么正常人,無論多么健康,都是有一定水平的游離DNA, 因為游離DNA是機體防御的一部分。

對中性粒胞外陷阱的研究還發(fā)現(xiàn), 這些網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以刺激凝血和血栓的形成【42】。 在動物模型里,人為提高游離DNA的水平,可以直接刺激凝血酶-抗血栓酶復(fù)合物的發(fā)生和增長, 表明游離DNA很可能參與了某種凝血刺激信號。 在由病原體激活的全血樣品中,游離DNA的主要來源是中性粒細(xì)胞。 中性粒胞外陷阱在形成血栓后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡,同時釋放游離DNA。 這個過程不同于通過細(xì)胞凋亡來是否游離DNA,因為沒有它沒有導(dǎo)致DNA長鏈的斷裂【44】。

我們知道凝血和血栓過程是機體自我保護(hù)的一種機制,但同時它在某些病理情況下也是對機體有傷害作用。無論是保護(hù)和傷害, 游離DNA參與凝血和血栓都說明,游離DNA不只是被動的、沒有功能的細(xì)胞成分, 而是細(xì)胞功能的一部分,是細(xì)胞的工具并可以被主動調(diào)控。 至于游離DNA是怎樣被調(diào)控的,并用怎樣的機理來調(diào)控血凝和血栓,現(xiàn)在人們的知識還很有限。 隨著液體活檢領(lǐng)域的科研和臨床研究的展開, 游離DNA在正常生理環(huán)境下的身份,一定會更加清晰。


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