原文出處

The Oncologist 2016; 21:1121-1130

作者

BENJAMIN LEVY,^a ZISHUO I. HU,^a,* KRISTEN N. CORDOVA,^b SANDRA CLOSE,^c KAREN LEE,^a DANIEL BECKER^d,*

作者所屬機(jī)構(gòu)

^aIcahn School of Medicine, Mount Sinai Health System, New York, New York, USA; ^bOncology Resource Group, San Francisco, California, USA; ^cGenEngine Group, Carlsbad, California, USA; ^dVeterans Affairs Hospital, New York University, New York, New York, USA Disclosures of potential conflicts of interest may be found at the end of this article. *Contributed equally.

關(guān)鍵字

非小細(xì)胞肺癌，液體診斷，無細(xì)胞DNA ，循環(huán)腫瘤細(xì)胞，微型RNA

摘要

在近年來，我們對肺癌基因組圖譜的深入理解使非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 的靶向治療得到了長足進(jìn)展。從歷史上來說, 肺癌晚期患者的診斷及基因鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)物通常為在計(jì)算機(jī)體層攝影 (CT) 引導(dǎo)下粗針/細(xì)針穿刺活檢獲取的組織。然而, 這一步驟常使患者處于危險(xiǎn)之中, 且結(jié)果也可能因樣本可用性及腫瘤異質(zhì)性的差異而較為混雜。此外, 完成這一診斷檢驗(yàn)需要一定的時(shí)間, 這可能對臨床治療造成不利的影響。近年來臨床技術(shù)的進(jìn)展引領(lǐng)了基于血液的診斷學(xué) (或稱“液體活檢”) 的飛速發(fā)展, 從而使應(yīng)用微創(chuàng)技術(shù)對肺癌進(jìn)行快速診斷和基因分型成為可能。最近有研究提示從無細(xì)胞DNA (cfDNA) 或循環(huán)腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的分子學(xué)突變可以作為腫瘤活檢的一項(xiàng)精準(zhǔn)分子指標(biāo), 進(jìn)而能可靠地預(yù)測患者對酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 治療的反應(yīng)。另外, 多項(xiàng)研究均證實(shí)microRNA (miRNA) 平臺在高危篩查患者中鑒別惡性與良性結(jié)節(jié)時(shí)具有高準(zhǔn)確性。盡管這些平臺的前景令人矚目, 但目前尚有許多問題, 包括各競爭平臺之間敏感性和特異性的差異, 以及技術(shù)和下游操作程序缺乏規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)等。本文回顧總結(jié)了液體活檢技術(shù)在NSCLC中的臨床應(yīng)用, 包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、蛋白質(zhì)組學(xué)、miRNA及cfDNA等, 并對這些平臺在診斷和治療上的臨床意義及面臨的挑戰(zhàn)提出了展望。

對臨床實(shí)踐的提示

腫瘤活檢是非小細(xì)胞肺癌診斷和基因分型的參考標(biāo)準(zhǔn), 但其腫瘤活檢的流程復(fù)雜, 可能延誤治療決策并影響臨床治療。液體活檢平臺，包括無細(xì)胞 DNA、蛋白質(zhì)組學(xué)信號、RNA (mRNA 和 miRNA) 及循環(huán)腫瘤細(xì)胞， 有潛力克服這些障礙, 如快速并準(zhǔn)確鑒定新發(fā)及耐藥基因突變、實(shí)時(shí)監(jiān)測治療應(yīng)答、預(yù)測患者轉(zhuǎn)歸并發(fā)現(xiàn)微小殘留病灶等。本文對非小細(xì)胞肺癌的新型液體診斷平臺提出了展望, 并討論了當(dāng)前和將來臨床應(yīng)用的前景和挑戰(zhàn)。

前言

肺癌一直是死亡率最高的癌癥之一，所有階段都考慮進(jìn)去，肺癌的5年存活率僅為17％[1]。盡管靶向治療的發(fā)展和新型免疫治療方法的出現(xiàn)取得了進(jìn)展，但非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的診斷和治療仍然存在重大挑戰(zhàn)。首先，雖然采用低劑量螺旋CT計(jì)算機(jī)斷層掃描（LDCT）篩查高?；颊呖赡茉试S早期檢測，但大約65％的患者仍然存在晚期疾病，1年以上死亡半數(shù)以上[1]。此外，對于接受治療意向治療的患者，目前，常規(guī)成像以外的任何策略都不可用于檢測復(fù)發(fā)或最小殘留疾病。最后，標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤活組織檢查可能是麻煩的，使患者處于危險(xiǎn)之中，并且由于不理想的組織獲取和腫瘤異質(zhì)性，可能無法準(zhǔn)確識別相關(guān)的分子改變。鑒于這些挑戰(zhàn)，迫切需要其他策略來幫助診斷有選擇分子驅(qū)動療法的患者的NSCLC和基因型腫瘤組織。

最近的技術(shù)進(jìn)步導(dǎo)致NSCLC中基于血液的診斷或“液體活檢”的發(fā)展。這種非侵入性方法允許早期檢測從頭或復(fù)發(fā)性疾病，結(jié)果的預(yù)后，識別引導(dǎo)靶向治療的遺傳改變以及治療反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。雖然液體活組織檢查物歷史上是指循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），但是定義已經(jīng)擴(kuò)展到包括蛋白質(zhì)組學(xué)，微小RNA（miRNA），信使RNA（mRNA）以及最近的無細(xì)胞DNA（cfDNA）。我們回顧了NSCLC中液體活檢的技術(shù)，并討論了這些平臺的診斷和治療意義。   

表1.鑒定遺傳改變的診斷方法

CFDNA

在1948年首先被Mandel和Metais發(fā)現(xiàn)，碎片DNA或cfDNA已經(jīng)與許多病癥有關(guān)，包括終末期腎病，心肌梗塞，中風(fēng)和創(chuàng)傷[2-7]。多項(xiàng)研究已經(jīng)顯示了cfDNA水平與細(xì)胞損傷和壞死程度之間的相關(guān)性，與癌細(xì)胞存活和繁殖相關(guān)的過程。隨著腫瘤體積的增加，可以超過吞噬細(xì)胞消除和清除凋亡和壞死片段的能力，導(dǎo)致cfDNA被驅(qū)動釋放到血液中[8]。或者，體外研究表明DNA可以通過活性機(jī)制釋放，其中癌細(xì)胞自發(fā)釋放DNA片段進(jìn)入循環(huán)[9]。根據(jù)腫瘤大小和血管分布，循環(huán)中釋放的cfDNA的量可以在血漿中存在的所有DNA的0.01％至90％之間變化[10]。與早期疾病相比，多項(xiàng)研究報(bào)道，與健康對照組相比，肺癌患者的cfDNA升高與晚期疾病相比增加了cfDNA濃度[11,12]。最近的基因組技術(shù)（包括數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)[D-PCR]，擴(kuò)增耐受突變系統(tǒng)[ARMS]，珠粒，乳液，擴(kuò)增和磁性[BEAMing]，標(biāo)簽擴(kuò)增子深測序和下一代測序[NGS]）可以檢測血漿或血清中的低水平的cfDNA，并鑒定相關(guān)的遺傳改變（表1）。調(diào)查人員最近不僅使用cfDNA來識別具有可行突變的患者，包括致敏（外顯子19和21）和抗性（T790M）EGFR突變，而且還作為對酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療的藥效學(xué)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

表2.評估NSCLC患者的cfDNA EGFR突變的研究

確定治療原始患者的突變：與組織活檢一致

基于血液的基因分型的一個(gè)關(guān)鍵問題是cfDNA是否可以作為EGFR突變鑒定中相應(yīng)組織的準(zhǔn)確分子代謝。 Kimura等人匹配的腫瘤和血清樣品衍生自用吉非替尼治療的42例晚期NSCLC患者[13]。在血清和組織中鑒定的EGFR突變之間的一致率為92.9％（在42個(gè)配對樣品中的39個(gè)中匹配），靈敏度為85.7％。在晚期NSCLC患者中，IV期單臂測試用例一線吉非替尼的一組患者中，高度一致率也有所差異[14]。治療前652匹配腫瘤和血漿樣本之間突變一致率為94.3％（95％置信區(qū)間[CI]，92.3-96.0），敏感度為65.7％（95％CI，55.8-74.7），特異性為99.8％ （95％CI，99.0-100.0）。報(bào)告血漿/血清和組織EGFR突變一致性的附加研究評估（表2）報(bào)道了跨度很寬的一致性數(shù)據(jù)（27.5％-100％），但是具有恒定的高特異性（71.4％-100％）。敏感性的差異與采用不同技術(shù)非常相關(guān)。評估cfDNA EGFR突變診斷標(biāo)準(zhǔn)的多元分析分別為61％和67.4％，特異度分別為90％和93.5％[15,16]。

通過NGS對cfDNA的遺傳詢問顯示超出EGFR的額外突變。在一項(xiàng)研究中，等位基因NGS基因分型為11例患者中的8例，準(zhǔn)確鑒定了兩個(gè)ALK重排，一個(gè)ROS1重排，一個(gè)RET重排，一個(gè)EGFR G719A突變，一個(gè)KRAS G12C和一個(gè)組合的KRAS G12C / PIK3CA [17]。在第二項(xiàng)研究中，54例使用血漿NGS評估的患者中有42例具有至少一個(gè)可識別的反應(yīng)，7例連接到U.S。食品和藥物管理局批準(zhǔn)的藥物和17資格獲得針對另一種疾病類型的靶向治療[18]。最后，使用具有捕獲點(diǎn)突變，插入/缺失，融合和擴(kuò)增能力的基于等離子體的數(shù)字NGS平臺，Mack等人回顧性分析了978例晚期NSCLC患者，并確定了412例患者（42％）中的可行突變[19]。其中包括激活EGFR突變（n5 116），ALK融合（n5 6），RET融合（n5 9），HER2外顯子20插入（n 5 9），BRAF突變（n5 26），MET外顯子14跳躍突變（n5 8），met擴(kuò)增（n5 18），EGFR外顯子20插入（n5 7）和KRAS / NF1 / MEK突變n5 213）。雖然現(xiàn)在沒有獲得組織樣本來做一致率的研究，但這項(xiàng)技術(shù)仍然有希望。

由cfDNA識別的EGFR突變的預(yù)測和預(yù)后效用

cfDNA的臨床前景植根于其作為靶向治療的預(yù)測生物標(biāo)志物的能力。在上述IV期吉非替尼研究中，EGFR突變陽性cfDNA患者無論突變亞型如何，與組織EGFR突變陽性腫瘤患者的總反應(yīng)率（ORR）相似（分別為76.9％和69.8％），提示基于血液的EGFR檢測可能與組織TKI治療有關(guān)[14]。血漿和組織中突變的匹配樣本患者的ORR更高（76.9％; 95％CI，65.4-85.5）與僅有突變陽性腫瘤組織的患者相比（59.5％; 95％CI，43.5-73.7）。相比之下，在針對EGFR突變的1217例初治患者中，吉非替尼與卡鉑 - 紫杉醇比較，亞歷山大研究（IPASS）233例患者的探索性分析顯示了類似的結(jié)果[20]。在194例提供預(yù)處理血清樣本的患者中，46例（23.7％）具有蝎型ARMS鑒定的cfDNA EGFR突變。雖然吉非替尼（n524）與化療相比（n522）治療的患者的ORR改善并不顯著（ORR，75％對64％; p5.40），但無進(jìn)展生存期（PFS）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改善）（危險(xiǎn)比[HR]，0.29; 95％CI，0.14-0.60; p，.001）。 cfDNA EGFR突變狀態(tài)和治療之間的顯著相互作用對于PFS是顯而易見的（相互作用測試，p.5045）。多個(gè)其他研究已經(jīng)證明了在cfDNA中鑒定的EGFR突變是TKI治療的可靠預(yù)測生物標(biāo)志物[13,21-25]。

最近的研究也證實(shí)了在TKI治療期間不同時(shí)間點(diǎn)的cfDNA中EGFR突變的定量變化的預(yù)測價(jià)值。 Tseng等前瞻性評估了62例晚期EGFR陽性患者接受吉非替尼血清和組織樣本的匹配[26]。使用肽核酸 - 拉鏈核酸PCR鉗夾方法在10周時(shí)評估cfDNA，并對疾病進(jìn)展進(jìn)行評估，研究表明，不能清除血漿EGFR突變是疾病控制率較低的獨(dú)立預(yù)測因子（優(yōu)勢比[OR] 5.26; 95％CI，1.13-24.44; p5.034），較短的PFS（HR，1.97; 95％CI，1.33-2.91; p5.01001）和總生存率（OS; HR，1.82; 95％CI， 1.04-3.18; p5.036）。 Mok等人使用cobas測試（Roche Molecular Diagnostics，Pleasanton，CA，http：// www。molecular.roche.com）評估患者的III期臨床研究中的血清/血漿EGFR突變，隨機(jī)分為六個(gè)周期的吉西他濱/鉑加順序厄洛替尼或安慰劑[25]。對于在基線時(shí)通過cfDNA進(jìn)行EGFR陽性治療的患者，與符合cfDNA持續(xù)性的患者相比，cfDNAatcycle3的消失相關(guān)性顯著改善PFS（HR，0.38; p 5 .0083）和較長的OS（HR，0.45; p.5 .0831） EGFR。最近，Marchetti等在TKI治療前進(jìn)行了具有已知組織和血漿EGFR突變的晚期患者（n5 20）的系列血漿樣品的PCR和超深層NGS。 14天時(shí)血漿EGFR拷貝數(shù)減少50％的患者（快速反應(yīng)者; n5 14）與沒有達(dá)到這種變化的緩慢反應(yīng)者（n5 6）相比具有更大的腫瘤縮小平均百分比（70％vs 30％; p，.0001）[27]。最后，Newman等人使用深度測序方法（通過深度測序進(jìn)行的癌癥個(gè)性化分析）來量化癌癥特異性基因組變異。能夠證明從接受化學(xué)療法或靶向治療的晚期階段患者（n5 3）的縱向樣本中分離的血漿ctDNA水平與治療期間的腫瘤體積高度相關(guān)[28]。 Insum，在這些研究中治療期間，突變的實(shí)時(shí)藥效學(xué)監(jiān)測，最顯著的EGFR突出了該平臺作為對治療的反應(yīng)或抗藥性的早期預(yù)測因子的潛力，可以為治療決定提供信息。

西班牙肺癌組已經(jīng)對西班牙肺癌組進(jìn)行了研究，預(yù)測厄洛替尼與標(biāo)準(zhǔn)化療的預(yù)后分析作為歐洲先進(jìn)EGFR突變陽性非小細(xì)胞肺癌患者（EURTAC）的一線治療。研究76例可識別的cfDNA EGFR突變患者[29]。使用TaqMan測定評估cfDNA中EGFR突變的亞型，研究表明L858R突變患者的中位OS比外顯子19缺失（13.7個(gè)月; 95％CI，7.1-17.7;對30.0個(gè)月; 95％CI，19.3-37.7; p，.001）。在組織中的41例L858R突變患者中，在cfDNA中也檢測到L858R突變的患者的中位生存期顯著縮短，在cfDNA中沒有檢測到突變（13.7對27.7個(gè)月; HR，2.22; p5 .03），提示了血漿cfDNA的 L858R突變的預(yù)后價(jià)值。

T790M在TKI耐藥患者和初次治療患者中的鑒定

幾項(xiàng)研究已經(jīng)確定了TKI-naive和耐藥患者的cfDNA中的抗T790M突變。 Kuang等通過ARMS和/或WAVE / Surveyor方法檢測EGFR T790M在來自對EGFR TKI的先前臨床反應(yīng)的28位患者中的15名，但僅有14名之前的患者具有先前的穩(wěn)定性疾病。血漿DNA中檢測到的EGFR T790M突變與先前對TKI的臨床反應(yīng)密切相關(guān)（p = .004）[30]。最近，等離子體BEAMing用于評估羅西利濱組的I / II期臨床試驗(yàn)，TKI選擇性靶向EGFR-陽性，晚期NSCLC患者的活化和T790M EGFR突變，其在EGFR導(dǎo)向治療期間經(jīng)歷疾病進(jìn)展[31 ]。以組織為參照標(biāo)準(zhǔn)，血漿T790M的一致性百分比為81％（195）。盡管血漿陽性和組織陽性T790M患者羅昔瑞尼的未確認(rèn)反應(yīng)率為53％，但所有血漿陽性患者對T790M均為組織陽性。在具有血漿或組織陽性T790M病變的患者中，已經(jīng)證明了另外第三代TKI的奧西替尼也有類似的結(jié)果。最后，使用與NGS結(jié)合的PCR方法，Husain et al。在22例EGFR陽性患者（68％）接受TKI治療的15例中鑒定出T790M突變。在15例T790M陽性患者中，10例患者在組織活檢中發(fā)生T790M突變，使用“臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正”[32]。

在初治患者中也已經(jīng)臨床檢測到了cfDNA中的T790M鑒定，并用于監(jiān)測實(shí)時(shí)反應(yīng)。 Wang等評估135例晚期NSCLC患者，臨床獲益為6個(gè)月以上（PFS.6個(gè)月），采用一線或二線TKI治療，并回顧性分析了TKI匹配前后TKI的EGFR敏化突變和T790M突變血漿通過多重測定，包括D-PCR [33]。在83例組織已知EGFR突變患者的隊(duì)列中，根據(jù)D-PCR前TKI血漿樣品中T790M的數(shù)量，將患者細(xì)分為3組（高，0.5％，n57;低，0％ - 5％，n5 20;零，0％，n5 56）。中位PFS分別為7.1、9.5和12.8個(gè)月（P = 0.001001），中，高分別為低值組和低氧組，平均OS為18.2,21.2和32.5個(gè)月（p5.005），表明高處理T790M突變負(fù)荷可能定義患者不太可能受益于TKI治療。 Sorensen等使用等位基因特異性PCR來鑒定23例接受二線TKI治療的晚期腺癌患者血漿中敏化和耐藥EGFR突變，作為大型臨床試驗(yàn)的一部分 [34]。在治療期間的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評估cfDNA，并且在使用實(shí)體腫瘤中的響應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)之前，在疾病進(jìn)展前344天的9名患者中顯示T790M突變，說明在常規(guī)成像之前鑒定抗性疾病的潛力。在Wang等人的上述兩項(xiàng)研究中和Sorenson等人，T790M沒有在組織樣品中詢問;因此，無法確定一致率。在TKI治療前，從頭開始還是臨床進(jìn)展之前，血漿或組織T790M的鑒別是否應(yīng)該引導(dǎo)T790M導(dǎo)向治療的治療決定。

 

蛋白質(zhì)

 

已經(jīng)研究了許多源自腫瘤和腫瘤微環(huán)境的蛋白質(zhì)作為NSCLC的生物標(biāo)志物。歷史上，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物包括癌胚抗原，細(xì)胞角蛋白-19片段和鱗狀細(xì)胞癌抗原。盡管幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明了這些標(biāo)志物的預(yù)后和預(yù)測價(jià)值，但由于其相對較低的靈敏度和特異性，它們在肺癌檢測中的應(yīng)用普遍具有有限的臨床應(yīng)用或作為反應(yīng)的替代。最近，已經(jīng)使用質(zhì)譜法（例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離）分類器來鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)特征。這些簽名是一種算法的基礎(chǔ)，該算法已經(jīng)導(dǎo)致了商業(yè)化測試，將高級階段患者與參考組相比分為“差”或“良好”組。這項(xiàng)測試既有預(yù)后和預(yù)后能力，也可以使用多西紫杉醇或厄洛替尼接受二線治療的晚期NSCLC患者[35]。幾項(xiàng)研究也突顯了該平臺在接受一線治療的晚期NSCLC患者中的預(yù)后效果，獨(dú)立于其他常見的預(yù)后因素[35-38]。

 

表 3. 報(bào)告循環(huán)miRNA作為NSCLC生物標(biāo)志物的研究

mRNA和miRNA

 

miRNA是預(yù)測在人類基因組中調(diào)節(jié)10％-30％的蛋白質(zhì)編碼基因的小型非編碼RNA。已被證明在腫瘤起始，入侵和轉(zhuǎn)移中起重要作用[39]。循環(huán)miRNA由于其使用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）的穩(wěn)定性和定量性而被認(rèn)為是有吸引力的癌癥生物標(biāo)志物[40]（表3）。對于NSCLC，循環(huán)miRNA已被調(diào)查其在診斷，預(yù)后價(jià)值和對治療的預(yù)測應(yīng)答方面的潛力。已經(jīng)為NSCLC鑒定了許多miRNA特征譜。

 

肺癌診斷與篩查

多項(xiàng)研究報(bào)道了miRNA對NSCLC診斷的潛在應(yīng)用。 Shen et al。確定了與健康個(gè)體相比，NSCLC患者（n = 5，58），血漿中的四個(gè)miRNA（miRNA-21，miRNA-126，miRNA-210和miRNA-486-5p）的一組顯著升高具有86％的敏感性和97％的特異性[41]。在探索性I / II期生物標(biāo)志物研究中，Hennessey et al。鑒定了能夠區(qū)分NSCLC（n5 55）和無癌患者（n 5 75）的miRNA對（miRNA-15b和miRNA-27b），特異性為84％（95％CI，0.73-0.91），靈敏度為100 ％（95％CI，0.93-1.0）[42]。 Leidinger等使用qRT-PCR分析來鑒定一組能夠從健康對照（n5 20）分離肺癌患者（n = 5 74）的五種標(biāo)志物，特異性為98％（95％CI，0.95-1.0），靈敏度為91％（95％CI，0.87-0.94）[43]。此外，他們能夠區(qū)分NSCLC患者（n = 5 74）與慢性阻塞性肺疾病患者（n5 26），特異性為81％，靈敏度為86％，使用10個(gè)miRNA標(biāo)記。

 

現(xiàn)在人們也已經(jīng)使用miRNA篩選具有發(fā)展NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。在鑒定出一組與NSCLC患者血清差異表達(dá)的10種miRNA與無癌癥對照相比較后，Chen等使用miRNA集回顧性分析了7例NSCLC患者在診斷前后的血清樣本[44]。他們發(fā)現(xiàn)他們的miRNA譜可以在臨床診斷前33個(gè)月內(nèi)鑒定癌癥。 Boeri等人鑒定了兩種不同的螺旋CT篩選試驗(yàn)患者中與肺癌相關(guān)的特異性血漿miRNA特征[45]。然后，miRNA特征分類器（MSC）算法在多中心意大利肺部檢測中有效地評估了939個(gè)等位基因（69例肺癌和870例） （MILD）臨床試驗(yàn)比較LDCT（n5 652）和觀察（n5 287）[46] .MSCs的靈敏度為87％，特異度為81％; LDCT靈敏度為79％，特異度為81％。一起使用MSC和LDCT導(dǎo)致LDCT假陽性率降低了五倍（從19.4％降至3.7％）。研究人員計(jì)算，使用兩個(gè)測試可以將篩選靈敏度提高到98％[46]。 Bianchi等比較93例患者在鼻咽癌患者中的血清樣本與非癌癥患者的血清樣本的NSCLC診斷相關(guān)性研究[47]。他們發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分具有早期肺癌（n534）的無癥狀高危個(gè)體的34 miRNA識別無癌癥（n = 30），靈敏度為71％，特異性為90％。評估13名患者在發(fā)展肺癌之前和之后，研究者還應(yīng)用了基于miRNA特征的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測算法，其在疾病發(fā)病后血清中的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)顯著增加（p.001，配對t檢驗(yàn)） 。

 

治療預(yù)后和預(yù)測反應(yīng)

使用全基因組測序，Hu et al。發(fā)現(xiàn)存活超過30個(gè)月的肺癌患者的血清中，11個(gè)miRNA被改變超過5倍，而存活時(shí)間少于25個(gè)月[48]。在11種miRNA中，4（miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499）與總體存活顯著相關(guān)。攜帶兩種或更多種高風(fēng)險(xiǎn)miRNA的患者與一種或不具有高危miRNA的患者相比，具有顯著增加的癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)（log-ranktest，p.0001; HR，3.14; 95％CI，1.65-5.97，對于兩種高風(fēng)險(xiǎn)miRNA載體; HR，16.52; 95％CI，8.62-31.68，用于三種高風(fēng)險(xiǎn)miRNA載體; HR，34.13; 95％CI，16.28-71.56，用于四種高風(fēng)險(xiǎn)miRNA載體）。據(jù)報(bào)道miR-155和miR-197水平在肺癌轉(zhuǎn)移患者中較高（p.05），并且在化療反應(yīng)良好的患者中顯著降低（p = .001）[49]。

除miRNA之外，還在早期和晚期肺癌患者中評估了信使RNA（mRNA）。癌癥/睪丸抗原（CTAs）是通常在睪丸中表達(dá)但通常在肺癌中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原。 Gumireddy等采用巢式PCR檢測法確定NSCLC肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中116 CTA基因的mRNA水平與吸煙相關(guān)性良性疾病患者差異表達(dá)[50]。一個(gè)基因AKAP4的表達(dá)能夠區(qū)分NSCLC患者（n5 264）和良性疾病個(gè)體（n5 135），以及具有良性結(jié)節(jié)的患者，面積為0.9714（95％CI， 0.956-0.986）和0.9825（95％CI，0.969-0.995）。與cfDNA相似，研究人員發(fā)現(xiàn)AKAP4與癌癥階段相比增加，IV期NSCLC患者的AKAP4 mRNA表達(dá)水平比I期NSCLC患者高3,254倍。 AKAP4 mRNA表達(dá)與煙草使用沒有顯著關(guān)聯(lián)，這可能使AKAP4被用作吸煙者和非吸煙者的篩選工具。

 

CTCs

 

CTC是腫瘤細(xì)胞通過實(shí)體腫瘤流入血液。他們非常罕見，在109例轉(zhuǎn)移性疾病患者中，每109例血細(xì)胞中只有少量血液細(xì)胞[51]。已經(jīng)開發(fā)了許多方法來檢測CTC，包括CellSearch系統(tǒng)（Janssen Diagnostics，Raritan，NJ，http：//www.janssen.com），智能系統(tǒng)仿真技術(shù)（ISET）系統(tǒng)（Aligent Technologies，Santa Clara， CA，http://www.aligent.com），流式細(xì)胞術(shù)，激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)，基于PCR的方法和CTC微芯片技術(shù)[52-55]。在CTC分離后，DNA可以與cfDNA相同的方式進(jìn)行提取和分析，其顯示EGFR突變[56,57]，ALK重排[58,59]和ROS1重排[60]。盡管已經(jīng)在高達(dá)85％的小細(xì)胞肺癌患者中鑒定了四氯化碳，但使用上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）的方法報(bào)道的NSCLC檢測率已經(jīng)顯著降低[61]。鑒于只有NSCLC CTC的亞群患有上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化和下調(diào)表皮生長因子，使用基于EpCAM的方法的檢測率較低。雖然使用基于非ePCAM的方法報(bào)道了更高的CTC檢測率，但是在獨(dú)立和大型多中心研究中，這些方法需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

 

治療預(yù)后和預(yù)測反應(yīng)

已經(jīng)證明CTC在轉(zhuǎn)移性NSCLC中具有預(yù)后意義[62,63]。使用ISET，Hofman et al。從208名NSCLC患者中分離出CTC，發(fā)現(xiàn)一個(gè)0.50的臨界值對應(yīng)于較短的OS和PFS。在全球meta分析中，不同階段肺癌患者預(yù)處理CTC的出現(xiàn)與淋巴結(jié)狀態(tài)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)[64]?？v向CTC監(jiān)測也顯示，CTC超過一次點(diǎn)陽性的患者生存率比CTC陽性或CTC陰性或持續(xù)陰性者的生存率差[65]。

 

EGFR突變和疾病監(jiān)測的存在

Breitenbuecher等人使用組合的RT-PCR和融合曲線分析顯示，EGFR突變體CTC的增加可能是疾病復(fù)發(fā)和EGFR-TKI抗性的指標(biāo)[56]。另外，與cfDNA一樣，CTC中的T790M鑒定已被用于TKI抗性患者，并監(jiān)測實(shí)時(shí)反應(yīng)。在用EGFR-TKI治療的NSCLC患者中，Maheswaran等在14例患者（64％）中有9例發(fā)現(xiàn)CTCs中有T790M突變，臨床進(jìn)展，突變存在與PFS降低相關(guān)（7.7個(gè)月對16.5個(gè)月; p .001）[57]。

討論

盡管NSCLC近期取得了治療進(jìn)展，但仍然存在嚴(yán)重的診斷挑戰(zhàn)，可能會導(dǎo)致治療決定瓶頸，并對臨床護(hù)理產(chǎn)生負(fù)面影響。我們審查的液體診斷平臺有可能克服許多障礙。也許最大的臨床效果是常規(guī)使用cfDNA來識別晚期疾病患者（即血漿基因分型）的從頭和抗性基因改變。腫瘤活檢的局限性最近得到了一項(xiàng)研究的支持，這項(xiàng)研究表明，盡管對組織進(jìn)行了機(jī)構(gòu)反射測試政策，但在社區(qū)學(xué)術(shù)中心的患者中，高達(dá)30％的患者沒有接受推薦的分子檢測指南[66]。此外，重復(fù)組織采集對臨床試驗(yàn)注冊構(gòu)成障礙，正如最近一項(xiàng)研究回顧性評估在加拿大單一機(jī)構(gòu)的55例臨床試驗(yàn)中的患者入選情況所證實(shí)的，其中較少的患者接受了試驗(yàn)強(qiáng)制組織標(biāo)本的試驗(yàn)治療，而不是沒有（55％vs. 83％; p，.001）[67]。血漿cfDNA平臺通過快速基因分型治療初治難治性患者提供了克服這些挑戰(zhàn)的希望，并且可能最終消除了許多臨床試驗(yàn)所要求的重復(fù)活組織檢查的需要。

 

除了血漿基因分型外，液體平臺還具有改善第一次癌癥和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高患者篩查的巨大潛力。在常規(guī)成像之前或結(jié)合常規(guī)成像鑒定早期或最小殘留病的目標(biāo)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。盡管美國國家肺癌篩查試驗(yàn)（NLST）顯示LDCT掃描肺癌死亡率降低了20％，但這種模式的高假陽性率值得進(jìn)一步增強(qiáng)。 mRNA和miRNA平臺在惡性結(jié)節(jié)描繪良性中的準(zhǔn)確性是有希望的，具有提高篩選技術(shù)的靈敏度和特異性的潛力。治療意向治療后，這些平臺也有助于監(jiān)測策略。最近對接受治療意向手術(shù)的結(jié)腸直腸癌患者的研究報(bào)告說，在所有患有最終復(fù)發(fā)但不能在無病患者的患者中，切除后確定了cfDNA [10]。

 

盡管肺癌液體診斷有希望，但仍然存在重大挑戰(zhàn)。在腫瘤異質(zhì)性的存在下，cfDNA采樣是否提供了整體腫瘤生物學(xué)的可靠分子代謝以及血漿或組織是否是疾病分子表征的真正參考標(biāo)準(zhǔn)是不確定的。迫切需要進(jìn)一步研究評估在cfDNA中識別的遺傳改變的預(yù)測效用，而不依賴于通過組織詢問識別的那些。此外，目前，沒有廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)可用于處理樣品，這可能有助于不同的測試結(jié)果。性能驗(yàn)證和方法開發(fā)，包括最佳準(zhǔn)備策略（收集，分離和存儲cfDNA）和下游分析需要認(rèn)真正式化。競爭平臺實(shí)驗(yàn)室之間的協(xié)調(diào)和溝通有助于促進(jìn)這一進(jìn)程。最后，鑒于報(bào)告的不同平臺的敏感性和特異性的廣泛范圍，對于前瞻性治療試驗(yàn)來說，必須要求血漿和/或血清的采集與組織的重復(fù)性一致率與臨床驗(yàn)證有關(guān)。應(yīng)特別注意臨床（腫瘤負(fù)荷）和抽樣變量對這些平臺的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的影響。重要的是要注意，迄今為止，很少（如果有的話）出版的系列已經(jīng)評估了具體商業(yè)平臺的準(zhǔn)確性或其與成對組織的一致性。因此，在解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎使用。此外，許多這些檢測的檢測閾值已經(jīng)任意設(shè)定，具有不同的內(nèi)部截止水平，從而使某些結(jié)果的解釋具有挑戰(zhàn)性。

 

除了技術(shù)上的考慮，液體平臺的應(yīng)用可能會產(chǎn)生新的治療困境。例如，是否應(yīng)執(zhí)行cfDNA中EGFR或T790M的藥效學(xué)監(jiān)測，并指導(dǎo)臨床或放射學(xué)進(jìn)展前的治療決策，對于接受TKI治療的患者尚不清楚。同樣，在治療意向治療之后，是否僅在等離子體中鑒定的最小殘留病變治療可改善患者的生存率也是未知的。應(yīng)該追求評估由等離子體測試引發(fā)的治療決定的前瞻性試驗(yàn)，獨(dú)立于臨床或放射學(xué)檢查結(jié)果，對于早期和晚期階段的患者。我們期待液體平臺的進(jìn)一步發(fā)展和完善及其日常使用不準(zhǔn)確地識別NSCLC各階段的復(fù)發(fā)和從頭疾病和基因分型患者。