Transl Lung Cancer Res. 2016 Dec;5 (6): 665-672

Comparison of methods for circulating cell-free DNA isolation using blood from cancer patients: impact on biomarker testing

Pérez-Barrios C , Nieto-Alcolado I , Torrente M , Jiménez-Sánchez C , Calvo V , Gutierrez-Sanz L , Palka M , Donoso-Navarro E , Provencio M , Romero A .

Abstract

The implementation of liquid biopsy for biomarker testing and response to treatment monitoring in cancer patients would presumable increase laboratory throughput, requiring the development of automated methods for circulating free DNA (cfDNA) isolation. The present study compares the MagNA Pure Compact (MPC) Nucleic Acid Isolation Kit I and Maxwell(®) RSC (MR) ccfDNA Plasma Kit and the later with QIAamp Circulating Nucleid Acid (QCNA) Kit using 57 plasma samples from cancer patients. cfDNA concentration was measured using the Qubit fluorometer. DNA fragments lengt were assessed using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Circulating tumor DNA (ctDNA) was quantified by digital PCR (dPCR). Firstly, we observed that MPC method significantly extracted less cfDNA than MR (P<0.0001). However, there were no significant differences in extraction yields of QCNA and MR kits. cfDNA isolation yield was also associated with tumor stage but not with tumor location. Secondly, an oligonucleosomal DNA ladder pattern was observed in 88% of the samples and significant differences in the recovery of mono-, di- and tri-nucleosomes DNA fragments were observed between MPC and MR methodologies. Finally, tumor mutation quantification on cfDNA was performed on 38 paired samples using digital PCR. Mutant allele fractions (MAFs) between paired samples were not significantly different. Methods for isolation of cfDNA can affect DNA yield and molecular weight fractions recovery. These observations should be taken into account for cfDNA analysis in routine clinical practice.

PMID: 28149760 [Pubmed - In-Data-Review]

1. 前言

       全球癌癥是發(fā)病和死亡的主要原因之一。多年來，癌癥的發(fā)病率有所增加，這一趨勢預計在不久的將來會上升_[1-3]。理解癌癥發(fā)展的生物學過程的最新突破已經(jīng)導致更有效的治療策略和靶向治療不可逆轉(zhuǎn)地改變了癌癥患者的治療。然而，使用這種療法需要在腫瘤活檢中進行生物標志物測試，并獲得足夠量的腫瘤材料用于分析可靶向基因中的體細胞突變是有些挑戰(zhàn)的。 

---

       由腫瘤細胞釋放的循環(huán)游離DNA（cfDNA）保留了原始組織的特征。因此，其研究允許通過非侵入性程序?qū)δ[瘤的遺傳表征，并解決常規(guī)活檢的困難_[4-6]。此外，與固體活組織檢查不同，在液體活檢中，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可以在治療過程中進行定量，這可能有助于測量腫瘤對治療的反應_[7-8]。在這種情況下，要測試的樣本數(shù)量有望大幅增加，因為開發(fā)高通量技術可以使cfDNA分離成為重要的挑戰(zhàn)。以這種方式，自動化系統(tǒng)的出現(xiàn)可以提高過程的重復性和魯棒性，并有助于在臨床環(huán)境中實施液體活檢。

       本研究的目的是比較兩個自動系統(tǒng)的cfDNA分離的性能，即MagNA Pure Compact（MPC）核酸分離試劑盒I（Roche Diagnostics，Penzberg，Germany）和Maxwell®RSC（MR）ccfDNA等離子體試劑盒（Promega Corporation，Madison，WI，USA），后者與QIAamp循環(huán)核酸）Kit（QIAgen，Valencia，CA，USA）手動提取試劑盒，這是最廣泛的用于cfDNA分離的方法之一。具體來說，我們比較了獲得的核酸的cfDNA提取產(chǎn)率和片段大小。最后，我們通過比較來自具有驅(qū)動突變的腫瘤患者的38個cfDNA樣品中的突變等位基因分數(shù)（MAF）測量通過數(shù)字PCR（dPCR）來檢查腫瘤特異性突變的鑒定是否可受cfDNA分離方法的影響。

2. 方法

2.1 樣本人群

       癌癥患者共獲得57份樣本，并在簽署了適當?shù)闹橥鈺笥?/span>2015年2月至6月期間進行了研究。該研究由醫(yī)院普埃爾塔德耶羅倫理委員會批準。該隊列由成年男性和女性診斷患有肺癌或結腸癌，臨床III-IV期（表S1）。從臨床和病理報告中獲得有關人口統(tǒng)計學，臨床病理特征和腫瘤突變狀態(tài)的信息。

2.2 實驗方法

       我們將57個周邊全血樣品收集在含有凝膠屏障的4mL PPT TM管（Becton Dickinson）中，以離心分離血漿。所有樣品在抽血時間后2小時內(nèi)在室溫下處理。在4℃下以1,500g離心10分鐘，將細胞級分與血漿分離。離心后，將55個血漿樣品分成兩等份1mL，將兩個血漿樣品分成3份等份1mL（圖S1）。將等分試樣在-80℃下立即儲存直到cfDNA提取。棄去溶血樣品進行進一步分析。在進行cfDNA提取的同時，樣品在4℃的冰箱中解凍。解凍后，以5000g進行新的離心20分鐘，以確保除去上清液中的雜質(zhì)。

       對于cfDNA分離方法比較，通過MR和QCNA處理31個樣品，通過MPC和MR處理24個樣品，并將兩個血漿樣品等分成三個并通過所有三種方法進行處理（圖S1）。使用MR儀器（Promega），使用制造商規(guī)定的MR ccfDNA等離子體試劑盒分離cfDNA，并根據(jù)制造商的說明書使用QCNA試劑盒（QIAgen），并遵循“1mL無細胞DNA定制”程序（除了當?shù)鞍酌?/span>K孵育過夜），并在MPC儀器（Roche Diagnostics）上使用MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I。 

在所有情況下，使用起始體積1mL的血漿提取cfDNA，并在50μL所提供的洗脫緩沖液中洗脫。根據(jù)制造商的說明書，使用Qubit dsDNA HS Assay試劑盒（Invitrogen，Life Technologies，CA，USA）在Qubit 2.0熒光計（Invitrogen，Life Technologies，CA，USA）上測量cfDNA濃度。 

       基于制造商推薦的方案，使用Agilent 2100生物分析儀和高靈敏度DNA芯片（Agilent Technologies Inc.，Palo Alto，CA，USA）進行微流控電泳，以評估50至7000個堿基對（bp）之間的DNA片段長度。通過dPCR分析cfDNA樣品，使用EGFR p.T790M（AHRSROS），p.L858R（AHRSRSV）和p.E746_A750delELREA（AHLJ0XO）中以下突變的罕見突變測定法進行分析。和突變在Quantas 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，South San Francisco，CA，USA）的KRAS中的p.G12V（AHX1IHY），p.G12D（AH6R5PI）和p.G13D（AHD2BW0）。對于dPCR，將8μL模板cfDNA與20μL反應體積中的0.5μL上述40×TaqMan測定和10μL的2×QuantStudio 3D Master Mix混合。隨后，將15μL加載到QuantStudio 3D Digital PCR 20K芯片中。循環(huán)條件如下：96℃初始變性10分鐘，56℃2分鐘40個循環(huán)，98℃30秒，72℃10分鐘，最終樣品維持在22℃至少30分鐘。芯片熒光讀取兩次。使用QuantStudio_®3D Analysis Suite?云軟件分析結果。需要時，手動調(diào)整每個數(shù)據(jù)集群的自動呼叫分配。測定結果報告為突變型DNA分子相對于突變體和野生型（wt）DNA分子總和的比例。每次運行都包含了wt對照DNA。

3. 統(tǒng)計分析

       定性變量通過其頻率分布和定量變量的平均值和標準差（SD）或中位數(shù)和四分位數(shù)范圍進行歸納總結。使用不同方法使用相同血漿樣品的不同等分試樣的cfDNA濃度產(chǎn)率的非參數(shù)比較使用配對數(shù)據(jù)的Wilcoxon有符號秩檢驗進行評估。使用Mann-Whitney U檢驗進行不同臨床情況（例如腫瘤來源（肺癌對結腸直腸癌）或腫瘤分期（IV期與其他）的不同臨床情況的cfDNA濃度產(chǎn)率的非參數(shù)比較。分類變量之間的關聯(lián)通過McNemar's Test測試。空假設被小于0.05的I型誤差拒絕。循環(huán)游離核小體結合DNA片段的相對定量表達為特定片段的濃度與相應樣品中cfDNA的總濃度之間的比例。使用不同方法在配對樣品中獲得的循環(huán)游離核小體結合的DNA片段比例之間的比較通過Wilcoxon signrank測試來評估配對數(shù)據(jù)。對于這一分析，根據(jù)多次比較的Bonferroni校正，將顯著性水平調(diào)整為0.0083。 統(tǒng)計分析采用STATA 9.0 SE進行。

4. 結果

4.1 根據(jù)方法提取的cfDNA產(chǎn)量的比較

       研究中包括的人群主要是白種人（95％），年齡從41歲到82歲。在收集的57個血漿樣本中，47個樣品對應于肺癌患者，10個樣品對應于結腸直腸癌?？偣矞y量了從57個血漿樣品獲得的總共116個樣品中的cfDNA濃度?？傮w而言，定量結果顯示癌癥患者血漿中的cfDNA濃度范圍在0.2至24ng /μL之間。

圖1: cfDNA樣品的電泳和凝膠狀圖像

（A）對應于低片段cfDNA的180bp峰；（B）對應于單、雙核小體和長片段cfDNA的峰。

FU：熒光單位; L： DNA分子量標準物； S：樣品; cfDNA，循環(huán)游離DNA

      為了比較，通過MR和QCNA從33個血漿樣品中提取cfDNA。該子集樣品來自肺癌患者，臨床III-IV期，除了一個與診斷為結腸直腸癌的患者相對應的樣品外。根據(jù)我們觀察到，與非轉(zhuǎn)移患者相比，從IV期癌癥患者獲得的cfDNA的量顯著更高。對于使用MR和QCNA方法分離的cfDNA樣品，這是正確的（P = 0.045和P = 0.0173）。關于MR和MPC方法的比較，使用兩種方法處理了26個血漿樣品。這些血漿樣品來自IV期結直腸癌患者和轉(zhuǎn)移性疾病的肺癌患者，除了一名IIIA期患者。有趣的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，MPC提取的顯著少于MR（1.154 vs. 2.31; P <0.0001）。我們還調(diào)查腫瘤位置（肺或結腸）是否可以影響cfDNA分離產(chǎn)率。我們的數(shù)據(jù)表明，通過MPC或MR方法處理的樣品中，根據(jù)腫瘤定位，cfDNA產(chǎn)量沒有顯著性差異（P = 0.9355和0.4834）。

表1: 通過MR，CNAQ和MPC提取的單，雙和三核小體片段的cfDNA濃度與總濃度之間的比率的中位數(shù)（p50），下四分位數(shù)（p25）和上四分位數(shù)（p75）

4.2 根據(jù)方法比較循環(huán)游離核小體結合DNA片段分布

       以生物分析儀2100的方式，對從MR和QCNA提取的22個血漿樣品中獲得的44個cfDNA樣品和通過MR和MPC方法提取的17個血漿樣品獲得的34個cfDNA樣品進行了分析。

觀察到的cfDNA片段的大小為約180bp（平均182bp，范圍為151-205bp）。在78個cfDNA樣品中的69個中，我們還觀察到寡核苷酸DNA梯形圖，因為在電泳測定（圖1）中清楚地觀察到對應于單，二和三核小體的峰的存在，表明凋亡細胞死亡。我們還檢測到78個cfDNA樣品中的54個中的高分子量（> 10000bp）DNA片段，其可以源于通過壞死死亡的細胞。

此外，寡核苷酸片段的比例根據(jù)提取方法而變化（表1）。值得注意的是，通過MPC方法提取的大小為150?200bp的cfDNA片段的比例顯著高于MR法（P = 0.0005），而與MPC提取的二核苷酸和三核苷酸結合的cfDNA比例顯著低于（P = 0.0024和P = 0.0038）。

圖2: 通過MPC和MR方法提取的配對cfDNA樣品上腫瘤突變定量的代表性散點圖

cfDNA：循環(huán)游離DNA；MPC：MagNA Pure Compact；MR：Maxwell®RSC

（A）患者MMM-96，p.E746_A750delELREA突變用FAM（藍色數(shù)據(jù)點）標記，而野生型cfDNA用VIC（紅色數(shù)據(jù)點）標記; （B）患者JMF-87，p.T790M突變用FAM標記，野生型cfDNA用VIC標記。

4.3 提取方法對腫瘤突變分析的影響

       病理報告顯示，在57例中，F(xiàn)FPE樣本中有26例發(fā)生藥物改變。其中17例對應于肺癌腫瘤中發(fā)現(xiàn)的EGFR突變，9例對應于結腸直腸腫瘤中發(fā)現(xiàn)的KRAS突變。在相應FFPE樣品中發(fā)現(xiàn)可藥用突變的26例患者中，我們能夠使用dPCR檢測從19個血漿樣品中分離的38個配對cfDNA樣品中鑒定出的變化。在圖2中顯示了用于成對的cfDNA樣品的腫瘤突變定量的代表性圖。在剩余的在cfDNA上沒有檢測到腫瘤改變的情況下，在治療期間提取血液樣品，并且診斷患者具有部分應答或完全響應到RECIST v1.1標準。

       在上述38個cfDNA樣品中，30個對應于通過MR和MPC平行提取的15個血漿樣品中配對的cfDNA樣品。定義為突變體DNA拷貝相對于突變體和wt DNA拷貝的總和的比例的MAF及其所有分析樣品的置信區(qū)間如表2所示。如圖所示，平均來說，MAF在用MR和MPC，根據(jù)方法對cfDNA的腫瘤突變定量沒有顯著性差異（P = 0.8647），表明提取方法對cfDNA突變分析的影響較小。

       最后，分析了MR和QCNA從四個血漿樣品中分離出的8個cfDNA配對樣品進行腫瘤突變檢測和定量（表3）。如先前觀察到的，配對cfDNA樣品之間的MAF相似。

5. 討論

       越來越多的證據(jù)支持在血液來源的樣品如cfDNA_[9-11]中可以有效檢測腫瘤突變。此外，采集的相對容易程度和微創(chuàng)性質(zhì)使得cfDNA成為縱向監(jiān)測癌癥疾病和對治療反應的有吸引力的臨床分析物_[7-8]。因此，預期臨床實驗室將管理的“液體”樣本數(shù)量將顯著高于FFPE樣本。在這種情況下，開發(fā)用于cfDNA隔離的自動化系統(tǒng)是一個重要的需要解決的問題。然而，提取階段對于確?？煽康慕Y果至關重要。值得注意的是，cfDNA具有一些特殊性，因為它們可以深刻地影響提取產(chǎn)率和下游應用。也就是說，cfDNA濃度通常很低，而且cfDNA高度片段化，其具有約180bp的短峰片段，其倍數(shù)似乎對應于核小體DNA_[12-13]。

       幾項研究比較了不同的提取方法，用于分離血清/血漿樣本中的cfDNA，確實證明提取方法可以顯著影響cfDNA的產(chǎn)量_[14-17]。類似地，我們觀察到MPC和MR提取方法在血漿樣品中的cfDNA回收率顯示出顯著差異（P <0.0001）。在比較QCNA試劑盒和MR時，我們發(fā)現(xiàn)后者在cfDNA產(chǎn)量方面并不優(yōu)于前者，但由于它是一種自動化方法，它更簡單和更快速。據(jù)我們所知，上述方法比較在文獻中以前沒有報道過。此外，我們的結果表明，測試的試劑盒顯示單，二核小體DNA片段的恢復顯著不同（表1）。應該在更大尺寸的隊列中驗證該觀察結果，因為已經(jīng)表明低分子量的cfDNA部分經(jīng)常表現(xiàn)出指示腫瘤衍生的DNA的遺傳畸變_[17-18]。

       如前所述_[5]，與非轉(zhuǎn)移患者相比，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病患者血漿中的cfDNA水平顯著升高。此外，我們已經(jīng)觀察到，在死亡患者中，cfDNA濃度隨疾病進程特別高而增加（數(shù)據(jù)未顯示）。平行地，已經(jīng)描述了與健康個體相比，循環(huán)核小體在癌癥患者中的濃度高得多_[19-21]。有趣的是，據(jù)報道，在各種腫瘤類型中，肺癌與循環(huán)核小體的最高值相關_[19-20]。類似地，我們在大多數(shù)分析的樣品中觀察到寡核苷酸DNA梯形圖（88％）。

       核小體釋放到循環(huán)中的機制被認為是由靶向治療如酪氨酸激酶抑制劑誘導的凋亡性細胞死亡_[22-23]。當追蹤靶向治療監(jiān)測的cfDNA突變時，應考慮此信息。如果通過不同程序分離cfDNA可以影響更短和更長的cfDNA片段的恢復，則腫瘤突變定量可能受到提取方法的影響是合理的。然而，根據(jù)cfDNA提取方法，我們沒有發(fā)現(xiàn)MAF的顯著差異。這可能部分是由于分析的樣本數(shù)量較少，更大尺寸的隊列將是特別有意義的，以澄清這個問題。值得注意的是，在一個樣品（表2中的RTS-12）中，我們無法檢測到由MR分離的cfDNA中的藥物改變，但在MPC提取的cfDNA中檢測到。如上所述，已經(jīng)表明，cfDNA的低分子量級分富集在腫瘤DNA中_[18-19]。根據(jù)我們的研究結果，雖然整個cfDNA提取產(chǎn)量顯著較低（P <0.0001），MPC方法大小從150至200bp的cfDNA片段的回收率顯著高于MR法（P = 0.0005）。這可以至少部分解釋觀察到的差異。

6. 結論

       在本文中我們證明，根據(jù)評估的方法，cfDNA提取產(chǎn)率和高分子量和低分子量cfDNA級分回收率有顯著差異。需要更大的研究來評估這些差異對下游應用的影響，例如用于靶向治療監(jiān)測的生物標志物測試或腫瘤突變跟蹤。

 參考文獻

1. International Agency for Research on Cancer, Cutado MP, Edwards B, et al. Cancer Incidence in Five Continents: Volume IX. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2008.

2. Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin 2014;64:9-29.

3.  American Society of Clinical Oncology. The state of cancer care in America, 2014: a report by the American Society of Clinical Oncology. J Oncol Pract 2014;10:119-42.

4. Swarup V, Rajeswari MR. Circulating (cell-free) nucleic acids--a promising, non-invasive tool for early detection of several human diseases. FEBS Lett 2007;581:795-9.

5. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977;37:646-50.

6. Aung KL, Board RE, Ellison G, et al. Current status and future potential of somatic mutation testing from circulating free DNA in patients with solid tumours. Hugo J 2010;4:11-21.

7. Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, et al. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol 2013;10:472-84.

8. Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med 2013;368:1199-209.

9. He C, Liu M, Zhou C, et al. Detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by mutantenriched PCR assay for prediction of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer. Int J Cancer 2009;125:2393-9.

10. Kuang Y, Rogers A, Yeap BY, et al. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant nonsmall cell lung cancer. Clin Cancer Res 2009;15:2630-6.

11. Romero A, Acosta-Eyzaguirre D, Sanz J, et al.

Identification of E545k mutation in plasma from a PIK3CA wild-type metastatic breast cancer patient by array-based digital polymerase chain reaction: Circulatingfree DNA a powerful tool for biomarker testing in advance disease. Transl Res 2015;166:783-7.

12. Jahr S, Hentze H, Englisch S, et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001;61:1659-65.

13. Suzuki N, Kamataki A, Yamaki J, et al. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. Clin Chim Acta 2008;387:55-8.

14. Repiská G, Sedlá?ková T, Szemes T, et al. Selection of the optimal manual method of cell free fetal DNA isolation from maternal plasma. Clin Chem Lab Med 2013;51:1185-9.

15. Fong SL, Zhang JT, Lim CK, et al. Comparison of 7 methods for extracting cell-free DNA from serum samples of colorectal cancer patients. Clin Chem 2009;55:587-9.

16. Holmberg RC, Gindlesperger A, Stokes T, et al. Akonni TruTip(®) and Qiagen(®) methods for extraction of fetal circulating DNA--evaluation by real-time and digital PCR. Kuhlmann JD, Schwarzenbach H, Wimberger P, et al. LOH at 6q and 10q in fractionated circulating DNA of ovarian cancer patients is predictive for tumor cell spread and overall survival. BMC Cancer 2012;12:325.

17. Schwarzenbach H, Eichelser C, Kropidlowski J, et al. Loss of heterozygosity at tumor suppressor genes detectable on fractionated circulating cell-free tumor DNA as indicator of breast cancer progression. Clin Cancer Res 2012;18:5719-30.

18. Holdenrieder S, Stieber P, F?rg T, et al. Apoptosis in serum of patients with solid tumours. Anticancer Res 1999;19:2721-4.

19. Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, et al. Nucleosomes in serum of patients with benign and malignant diseases. Int J Cancer 2001;95:114-20.

20. Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, et al. Circulating nucleosomes in serum. Ann N Y Acad Sci 2001;945:93-102.

21. Costa DB, Halmos B, Kumar A, et al. BIM mediates EGFR tyrosine kinase inhibitor-induced apoptosis in lung cancers with oncogenic EGFR mutations. PLoS Med 2007;4:1669-79; discussion 1680.

22. Faber AC, Li D, Song Y, et al. Differential induction of apoptosis in HER2 and EGFR addicted cancers following PI3K inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106:19503-8.