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首頁 專家論壇 標(biāo)本專家[文獻精讀] 無創(chuàng)產(chǎn)前診斷:從夢想到現(xiàn)實
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[文獻精讀] 無創(chuàng)產(chǎn)前診斷:從夢想到現(xiàn)實

2017-12-20 00:00來源:原版作者:Y. M. Dennis Lo (盧煜明)

原文出處

Clinical Chemistry 61:1 32–37 (2015)

作者

Y. M. Dennis Lo (盧煜明)

作者和文獻信息

Li Ka Shing Institute of Health Sciences and Department of Chemical Pathology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, Shatin, New Territories, Hong Kong SAR, China.Fax+852-2636-5090; e-mail: loym@cuhk.edu.hk.

* Address correspondence to the author at: Li Ka Shing Institute of Health Sciences and Department of Chemical Pathology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, Shatin, New Territories, Hong Kong SAR, China.

Received July 9, 2014; accepted July 10, 2014.

Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2014.223024

© 2014 American Association for Clinical Chemistry



當(dāng)我在牛津讀醫(yī)學(xué)院時,我對產(chǎn)前診斷領(lǐng)域產(chǎn)生了興趣。我一直在追蹤產(chǎn)前診斷血紅蛋白病的進展, 這是加州大學(xué)舊金山分校(1)的Yuet Wai Kan教授和牛津大學(xué)的David Weatherall教授(2)的開創(chuàng)性工作。在醫(yī)學(xué)院課程的后續(xù)工作中,通過在病理學(xué)家肯尼思·弗萊明博士(圖1)的團隊工作,我也有幸獲得了研究實驗室的第一手經(jīng)驗。有一天,我聽到了來自牛津大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Regius名譽教授約翰·貝爾教授的講座,當(dāng)時他剛剛從斯坦福大學(xué)返回牛津大學(xué)。貝爾教授談到了一種新的方法,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),引起了我的注意。在講課之后,我說服了貝爾教授教我這個方法。我很快就能體會到這種強大的方法的多功能性(3)以及潛在的缺點(例如,易受污染)(4)。 

我很快就對進一步改進產(chǎn)前診斷方法發(fā)生了興趣?;?span>DNA的產(chǎn)前診斷方法的一個重要缺點是胎兒組織的侵入性取樣,例如通過羊膜穿刺術(shù),當(dāng)時這是獲得胎兒細胞進行進一步分析所必需的。這種侵入性取樣對胎兒具有微小但是明確的風(fēng)險。為了避免這種風(fēng)險,許多科學(xué)家多年來一直夢想著進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的可能性。為了實現(xiàn)這一目標(biāo),自20世紀60年代末以來一直在嘗試分離已經(jīng)進入母親流通的胎兒有核細胞。然而,這種早期嘗試是基于常規(guī)細胞遺傳學(xué)(5)或染色(例如,用于雄性細胞的奎納克林染色)(6,7)方法。我以為可以使用PCR的靈敏度來檢測已經(jīng)進入母體循環(huán)的胎兒細胞。我進一步假設(shè),為了最大限度地獲得成功的機會,可以將兩個連續(xù)的PCR相結(jié)合。我將此稱為雙重放大系統(tǒng),現(xiàn)在更普遍地稱為嵌套PCR。使用這樣的系統(tǒng),我確實能夠證明母體血細胞中胎兒DNA的檢測(8)。其他工作者很快也報道使用PCR9,10)和分子細胞遺傳學(xué)方法(11),結(jié)合各種胎兒細胞富集技術(shù)檢測循環(huán)胎兒細胞。然而,包括我自己在內(nèi)的所有這些努力受到諸如假陽性和假否定性等問題的阻礙。造成這種困難的主要原因是母體血液中胎兒有核細胞的極度罕見(12)。另一個原因是某些胎兒細胞群從一個懷孕到下一個懷孕的持續(xù)存在(13)。事實上,我將花費未來8年在這方面工作,沒有取得重大成功。到2002年,已經(jīng)清楚的是,母體血液中胎兒有核細胞的罕見性將使得使用這種方法非常難以開發(fā)用于非侵入性產(chǎn)前檢測的實用和有力的方法(14)。因此,對這種基于細胞的方法的興趣已經(jīng)下降。


一九九七年對于我的出生地香港來說, 是一個非常特別的一年。那是自1841年以來香港成為英國殖民地之后,再回到中國的那一年。雖然許多人因為未來不確定而在一九九七年前離開香港,但我和妻子決定現(xiàn)在回到家鄉(xiāng)。知道我回到香港后,我需要建立新的職業(yè)生涯,所以我覺得這是嘗試新事物,甚至是冒險的好時機。 19969月,在我返回香港前4個月,在《自然醫(yī)學(xué)》上有人發(fā)表了2篇關(guān)于腫瘤DNA在癌癥患者獲得的無細胞血液中的存在的文章(15,16)。我認為在癌癥患者中生長的癌癥有點類似于在母親子宮內(nèi)發(fā)育的胎兒,雖然在我的臨床實踐中還沒有看到像8磅的寶寶一樣大的癌癥。因此,我認為我們應(yīng)該能夠檢測母體血液中的無細胞部分,即血漿或血清中的胎兒DNA。與牛津大學(xué)的血液學(xué)家James Wainscoat教授合作,我們能夠證明胎兒DNA確實存在于母體血漿和血清中(17)。事實上,大多數(shù)情況下,當(dāng)母親懷孕男性胎兒時,我們只能使用10升煮沸的血漿或血清來獲得強壯的胎兒Y染色體信號,表明這些樣品中無細胞胎兒DNA的濃度應(yīng)該非常高。

 

渴望了解在母體血漿和血清中可以發(fā)現(xiàn)胎兒DNA的濃度,我研究了DNA定量分析的方法。在1996年底,一種稱為實時PCR的方法,其中一個將監(jiān)測DNA擴增反應(yīng)的進展,從而準確測量輸入的DNA濃度,剛剛公布(18)。然而,為了執(zhí)行這樣的技術(shù),將需要一種昂貴的儀器,其基本上是組合的PCR熱循環(huán)儀和熒光相機。在一九九六年的拳擊節(jié),我被邀請到Magnus Hjelm教授在倫敦附件的家里聚會,Hjelm教授是我未來在香港的系主任。我決定請他在香港的新實驗室安裝一臺實時PCR機。相當(dāng)令人驚訝的是,赫杰爾教授幾乎是不假思索第同意了我的要求,這是我一生中最好的圣誕禮物!


我于19971月開始在香港工作,并開始測定母體血漿和血清中胎兒DNA濃度的項目。母體血漿胎牛血漿DNA分數(shù)顯著高于妊娠早期平均約3%,妊娠晚期為6%(19)。這些濃度遠高于存在于母體血液中的胎兒有核細胞的相應(yīng)數(shù)字,母體血液中每105個或106個母細胞通常為1個胎兒細胞水平或者更低。此外,對于在懷孕期間多次采樣的孕婦隊列的連續(xù)分析表明,早在孕周第七周,胎兒DNA就存在于母體血清中。總而言之,這些數(shù)據(jù)表明,母體血漿中的胎兒DNA將是非侵入性產(chǎn)前診斷的有價值的材料。其非常高的濃度將表明使用這種材料的產(chǎn)前檢測潛在地比使用母體血液中的胎兒細胞更加堅固。此外,不同胎齡的胎兒DNA濃度范圍將成為基于此材料建立診斷平臺的基礎(chǔ)。


如上所述,胎兒細胞在母親血液中的使用是無創(chuàng)的產(chǎn)前診斷,因為某些胎兒細胞群從一個懷孕到下一個懷孕的持續(xù)存在是復(fù)雜的(13)。我想看看這種現(xiàn)象是否也會使母體血漿中無細胞胎兒DNA的診斷使用復(fù)雜化。因此,我招募了一些做剖腹產(chǎn)的婦女,并在分娩后的多個時間點取血。結(jié)果表明,分娩后胎兒DNA從母體血漿中迅速清除,半衰期約為16 分鐘(20)。因此,這些數(shù)據(jù)表明,與母體血液中的胎兒細胞不同,在母體血漿中使用無細胞胎兒DNA進行產(chǎn)前診斷不會與以前的懷孕持續(xù)存在并存。


因此,通過上述3項研究奠定了該現(xiàn)象的基本生物學(xué)參數(shù)(17,19,20),我決定在胎兒蛻膜D血型的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中應(yīng)用無細胞胎兒DNA檢測方法,Rh D陰性。這種應(yīng)用在臨床上是有用的,因為Rh D陰性母親如果胎兒是Rh D陽性可能是免疫敏感的,并且可能產(chǎn)生抗體以在隨后的涉及Rh D陽性胎兒的懷孕中侵襲胎兒紅細胞。因此,能夠確定哪些維生素D陰性孕婦處于危險中,哪些不是。我能夠證明用母體血漿和實時熒光定量PCR(21)可以高精度確定胎兒Rh血型。該測試現(xiàn)在已經(jīng)在歐洲從2001年左右開始進行臨床檢測,幾年后在美國出現(xiàn),代表了基于DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的第一個臨床應(yīng)用。


胎兒染色體非整倍體如唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷是懷孕婦女進行產(chǎn)前檢測的最常見原因之一。我已經(jīng)表明懷孕婦女?dāng)y帶唐氏綜合征胎兒的血漿中無細胞胎兒DNA的濃度高于攜帶染色體正常胎兒的血液中的濃度(22)。因此,母體血漿DNA分析可用作胎兒唐氏綜合征的篩查試驗。挑戰(zhàn)是在唐氏綜合征組和正常組之間的濃度范圍內(nèi)存在一些重疊,因此在成為有價值的測試工具之前,需要改進測試的診斷靈敏度和特異性。然后我接下來的十年,探索可以增強這種測試的各種方法。


唐氏綜合征是由21號染色體上遺傳物質(zhì)的劑量增加引起的,最常見的是由染色體的額外拷貝的存在引起。因此,唐氏綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測的關(guān)鍵是開發(fā)可以準確測量這種染色體劑量增加的方法。因為胎兒DNA通常作為母體血漿中發(fā)現(xiàn)的總DNA的較小部分存在(19),所以可以提高這種染色體劑量測量的性能的一種方法是將DNA分子的子集定位在母體血漿中到胎兒我推測來自不同組織的DNA分子可能對其DNA具有不同的生物化學(xué)修飾,因此可能會發(fā)現(xiàn)可以使胎兒與血漿中母體DNA區(qū)分開的修飾。這些修飾通常被稱為表觀遺傳改變。研究類型最多的表觀遺傳變化是DNA甲基化。在2002年,我描述了一種基于DNA甲基化的方法,并證明其用于檢測母體血漿中的胎兒DNA(23)。隨后的實驗表明,這種方法確實可以用于檢測唐氏綜合征(24)和另一種稱為愛德華綜合征的染色體紊亂(25)。


在我正在探索使用DNA甲基化的同時,我也并行研究了另一種方法。我認為在不同組織中的細胞之間,將被接通的基因?qū)⑹遣煌摹R虼?,在胎兒組織中優(yōu)先接種但在母體組織中被切斷的基因?qū)⒋砹硪活愄禾禺愋詷?biāo)記物,可用于母體血液中的檢測。然后轉(zhuǎn)向檢測基因表達產(chǎn)物,即信使RNA(mRNA),并在2000年顯示胎兒mRNA確實存在于母體血漿中(26)。母體血漿中胎兒mRNA的檢測有些令人驚訝,因為當(dāng)時的一般信念是mRNA非常脆弱,因此在存在各種核酸酶的血漿中極不可能存活。隨后的研究表明,這種循環(huán)的mRNA分子被顆粒保護(27,28)。進一步的工作表明,血漿mRNA分析可用于唐氏綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(29)。


而基于DNA甲基化和mRNA分析的方法代表檢測胎兒染色體紊亂的可行方法,基于這種方法的良好標(biāo)記物需要大量的優(yōu)化努力,并且在許多情況下需要對DNA變異(例如單核苷酸多態(tài)性)的標(biāo)記的伴隨分析,不適用于所有胎母對。因此,我決定研究一種沒有這種限制的方法。一種方法是開發(fā)極其精確的量化方法,使得可以測量胎兒染色體劑量變化(例如,唐氏綜合征的情況下增加),即使這種變化被母體DNA的背景部分掩蓋等離子體。

我認為可以實現(xiàn)這一點的一個方法是一次計數(shù)母體血漿中的DNA分子。使用這種策略,只要增加分子數(shù)量就可以達到任何程度的精度。我與香港中文大學(xué)的Rossa ChiuAllen Chan合作(圖2),我們在2007年報告說,這種方法的確可以使用單分子PCR(更通常稱為數(shù)字PCR)(30 )。然后,我們在2008年顯示,大規(guī)模并行測序(也稱為下一代測序)提供了超過數(shù)字PCR的實現(xiàn)這種計數(shù)方法的顯著優(yōu)點,并且將允許使用具有非常高的靈敏度和特異性的母體血漿檢測胎兒唐氏綜合征(31) 。然后,我們對該技術(shù)進行了大規(guī)模的多中心驗證研究,達到100%的診斷靈敏度和98%的特異性(32)。這項研究的結(jié)果已被其他組復(fù)制(33,34)。該技術(shù)于2011年下半年被引入臨床服務(wù),在接下來的3年中已經(jīng)在50個國家進行了70萬例母體血漿樣品。這個進展代表了最快速采用的基因組測試之一。


在實現(xiàn)強大的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測唐氏綜合癥之后,我想探索推動這項技術(shù)有多遠。因此,2010年,我的研究團隊成功開發(fā)了一種從母體血漿測序整個胎兒基因組的方法(35)。這種方法是基于對母體血漿的深度測序,可以涵蓋人類基因組幾十次。然后從參考胎兒父親和母親的基因組序列的測序數(shù)據(jù)中推斷胎兒基因組。這種方法已被其他工作人員證實(36,37)。超越基因組,在2013年,我的小組進一步表明,可以從母體血漿中確定胎兒表觀基因組(38)。這種方法將是探索胎兒基因組生物化學(xué)修飾與生理或病理發(fā)展之間復(fù)雜關(guān)系的潛在有價值的工具。


由于我在血漿DNA中的工作最初受到癌癥領(lǐng)域的工作的啟發(fā)(15,16),我決定在我的胎兒工作的同時,繼續(xù)使用血漿DNA進行癌癥檢測。因此,我已經(jīng)開發(fā)了類似于相應(yīng)的胎兒DNA測試,使用實時PCR(39),DNA甲基化標(biāo)記(40),血漿mRNA標(biāo)志物(41)等的癌癥測試。最近,由于等離子體的成功用于檢測胎兒染色體異常的DNA測序(31,42),我的小組也探索了一種類似的方法來試圖開展癌癥的普遍檢測。我們最近在這一領(lǐng)域的數(shù)據(jù)非常有希望(43,44),并且已經(jīng)表明這種方法可用于使用血液樣本檢測多種類型的癌癥。我們的結(jié)果得到了其他團體的支持(45,46)。


在過去的17年里,我一直為在無創(chuàng)產(chǎn)檢的進展而激動,我證明了胎兒DNA在母體血漿中的存在并且開發(fā)出了分子診斷技術(shù)來研究這個領(lǐng)域。我和我的研究團隊也非常受到鼓舞,因為我們看到這項技術(shù)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到應(yīng)用,使產(chǎn)前檢測對孕婦的壓力更小,對嬰兒也更安全。這同時也是一個適當(dāng)?shù)臅r機讓我們各界探討這項新技術(shù)(47)的相關(guān)的各種社會的、法律的和倫理的話題,并探討這個新技術(shù)更好地融入我們的醫(yī)療體系。



作者貢獻:所有作者證實他們對本文的知識內(nèi)容作出了貢獻,并符合以下3個要求:(a)對概念和設(shè)計,數(shù)據(jù)采集或數(shù)據(jù)分析和解釋作出重大貢獻; (b)起草或修改有關(guān)知識內(nèi)容的文章; (c)最后批準已發(fā)表的文章。


作者的披露或潛在的利益沖突:在手稿提交時,所有作者完成了作者的披露表格。披露和/或潛在的利益沖突:

就業(yè)或領(lǐng)導(dǎo):Y.M.D. Lo,Xcelom Limited,臨床化學(xué),AACC。

顧問或咨詢角色:Y.M.D. Lo,Sequenom,Inc.

股權(quán)所有權(quán):Y.M.D. Lo,Xcelom Limited,Sequelom,Inc

榮譽:沒有宣布。

研究經(jīng)費:Y.M.D. Lo,大學(xué)教育資助委員會優(yōu)異獎計劃(AoE / M-04/06),李嘉誠基金會,S. Yee基金會,Sequenom公司,香港研究資助局和創(chuàng)新及科技基金。

專家證詞:沒有聲明。

專利:Y.M.D. Lo,20多項專利或?qū)@暾?,都在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測領(lǐng)域。


致謝:科學(xué)研究是集體的努力。在這方面,我要感謝我的研究團隊和合作者在過去多年與我的合作。我也要感謝參加這個研究計劃的懷孕的母親。這篇文章的早期版本是在費薩爾國際國際醫(yī)藥獎2014年發(fā)表的時候發(fā)表的,并在費薩爾國王基金會的許可下發(fā)表在這里。


 

文獻引用


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